НАПРАВЛЕНИЕ на ИФ и РТГА,ПЦР (грипп)
Лабораторная диагностика гриппа и острых и респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 3.1.2.3117-13 «Профилактика гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций».
Согласно приказу Управления Роспотребнадзора по Республике Башкортостан и Министерства здравоохранения Республики Башкортостан №2208-Д/256 от 21.07.2016г. ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Башкортостан» на безвозмездной основе обеспечивает лабораторную диагностику гриппа, ОРВИ, выделение и идентификацию вирусов гриппа, изолированных от больных, доставленных из прикрепленных к опорной базе медицинских организаций используя следующие методы:
- метод ПЦР - обнаружение РНК вирусов гриппа. Лабораторные исследования проводятся для людей с тяжелой клинической картиной, пневмонией.
- методом иммунофлюоресцентного анализа - выявление антигенов вируса гриппа и ОРВИ при исследовании мазков из носоглотки,
- серологического метода (реакция торможения гемагглютинации - РТГА) диагностически значимое увеличение уровня (титра) специфических антител во второй сыворотке (по сравнению с первой) в 4 и более раз при одновременном исследовании в стандартных серологических тестах парных сывороток крови больного.
1. Методом иммунофлюоресцентного анализа (ИФ):
-биоматериал - мазки из носовой полости (цилиндрический эпителий, содержащий вирусные антигены) (отбор в первые три дня заболевания);
2.Серологического исследования (РТГА):
-является парные сыворотки крови пациента (первая порция крови из вены должна быть отобрана в начале заболевания (1-3 день). Вторая порция - в период реконвалесценции (на 10-12 день заболевания и позднее).
3. Для метода ПЦР забирают 5 видов клинического материала:
-мазки из полости носа и ротоглотки
-смывы из полости носа и смывы из ротоглотки
-носоглоточное отделяемое
Отбор материала для исследования вирусных антигенов.
Отбор клинических материалов должен проводиться обученным персоналом с применением средств индивидуальной защиты.
Отбор материала проводится в соответствии с методическими рекомендациями
N 0100/4434-06-34 «Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом».
Методические рекомендации "Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высокопатогенными штаммами вируса гриппа А (H1N1), у людей".
Отбор, упаковка, хранение и транспортировка проб должна проводиться в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".
Процедура отбора материалов. Практически во всех случаях достаточно только мазка из носа и /или парную сыворотку крови
1. Мазки из носовой полости (ИФ).
Если материал берется у маленьких детей, во избежание повреждения слизистой при резких движениях ребенка нужна помощь ассистента, который усаживает его к себе на колени, одной рукой прижимает руки ребенка, а другой рукой - голову. Детей старше 7 лет и взрослых больных усаживают в положение с приподнятым носом.
Пациент должен высморкаться. При обильном слизистом или слизисто-серозном отделяемом необходимо очистить полость носа сухим ватным тампоном. При обильных гнойных выделениях проводят наиболее тщательную очистку носовых ходов, без чего материал для исследования забирать не следует, поскольку обилие детрита и неспецифически светящихся лейкоцитов не позволит провести исследование.
Сухой тонкий тампон вводят в нижний носовой ход как можно глубже (взрослым и школьникам - на глубину до 3 см, детям более младшего возраста - на 1,5-2 см). Вращательным движением с небольшим прижатием тампона к стенкам носа снимают со слизистой бокаловидный эпителий. Процедуру повторяют другим ватным тампоном со вторым носовым ходом. Ватную часть тампона на 1,5-2 см. погружают в стерильную пробирку с забуференным физиологическим раствором. Не допускается сухой тампон!
Приготовление фосфатного солевого буферного раствора
1. 38,25 г натрия хлористого (NaCl) и 7,12 г натрия фосфорнокислого двузамещенного (Na2HPO4) последовательно растворяют в 4,5 л дистиллированной воды (раствор А).
2. 4,25 г натрия хлористого (NaCl) и 1,36 г калия фосфорнокислого однозамещенного (КH2PO4) последовательно растворяют в 0,5 л дистиллированной воды (раствор В).
3. Добавляют раствор В к раствору А до получения рН 7,2-7,4.
4. Раствор хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 1 недели.
Для метода ПЦР подходит как забуференный физиологический раствор, так и обычный физиологический раствор.
2.Мазки из ротоглотки (для ПЦР).
Мазки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки после предварительного полоскания полости рта водой. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида или раствора фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.
3. Смыв из полости носа (для ПЦР).
Сбор материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью одноразового шприца вводят по 3-5 мл теплого стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку.
4.Смывы из ротоглотки (для ПЦР).
Перед сбором материала необходимо предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-15 сек) 8-10 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку.
5. Носоглоточное отделяемое.
Производится натощак после взятия мазков из полости носа. Осуществляется двумя способами:
1. Больной в три приема прополаскивает горло 10-15 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Смыв собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы с завинчивающимися крышками объемом 50 мл. Ватными тампонами, зажатыми пинцетом, протирают заднюю стенку глотки и носовые ходы. Ватные тампоны опускают во флакон со смывом.
2. Сухим или слегка увлажненным 0,9% раствором натрия хлорида тампоном, который удерживают с помощью пинцета, протирают заднюю стенку глотки и опускают его в пробирку с 5 мл стабилизирующей среды. Процедуру повторяют 2-3 раза. Все тампоны от одного больного собирают в одну пробирку. После взятия материала с задней стенки глотки тщательно протирают носовые ходы небольшими ватными тампонами и опускают их в ту же пробирку. Пробирку закрывают.
6. Кровь для серологических исследований (РТГА).
Кровь должна быть получена из локтевой вены в количестве 3-5 см3 в стерильную сухую пробирку. После отделения сыворотки проба должна быть помещена в чистую посуду (например, в пробирку Эппендорфа), герметично закрыта и сохраняться до забора второй пробы крови при температуре (+4-+8С). Объем каждой пробы сыворотки должен быть не менее 1,5-2 мл. Транспортировка обеих проб должна осуществляться при температуре (+4-+8С).
Транспортировка и хранение мазков.
Тампон со снятыми клетками немедленно погружают в пробирку с 2-3 мл 0,01 М фосфатного солевого буфера, рН 7,2-7,4. Тампоны как можно быстрее (не более чем за 2 часа) доставляют в лабораторию в охлажденном состоянии. Замораживание должно быть исключено.
Хранить пробирки с материалом более 2 ч не рекомендуется, так как при этом происходит разрушение эпителиальных клеток и выход вируса в среду, что снижает результативность иммунофлюоресцентного анализа.
Пробирки с тампонами должны быть дополнительно герметизированы скотчем или лейкопластырем для предотвращения разгерметизации и контаминации при транспортировке.
Маркировка проб и оформление сопроводительных документов
Каждая проба должна быть маркирована. Маркировка проб должна соответствовать сопроводительным документам.
